Prepareren van genitalia van Lepidoptera

Erik J. van Nieukerken

Voor het determineren van vlinders is het vaak noodzakelijk om een preparaat van de genitalia te maken. Voor het beschrijven van soorten is dit zelfs noodzakelijk: de belangrijkste diagnostische kenmerken vindt men in de genitalia. Ook bij de meeste andere insectenordes worden de genitalia bestudeerd na het maken van een preparaat.
Bij het prepareren worden de zachte weefsels opgelost en blijven de gechitiniseerde skeletdelen over: deze bevatten de kenmerken.
Het maken van genitaalpreparaten van vlinders is niet bijzonder moeilijk, het vraagt wel enig geduld en voorzichtigheid. Een preparaat is wel van groot belang voor de determinatie en voor documentatie van zeldzamer materiaal, met name natuurlijk voor onbeschreven soorten.
Voor taxonomisch onderzoek worden meestal permanente preparaten gemaakt in een uithardend inbedmedium, bijv. Canadabalsem of Euparal (niet Entellan!).
Het goed maken van preparaten is essentieel voor taxonomisch onderzoek. Helaas zien we ook op het museum vaak slechte preparaten en soms zelfs totaal onbruikbare, helaas ook van geleend materiaal! De algemene informatie hieronder is niet allemaal relevant voor het tijdelijke preparaat van de cursus, het dient als documentatie.

Vooraf
Bedenk goed waarvoor je preparaten maakt: determinatie, beschrijven soorten, etc. Probeer eerst in de literatuur te kijken hoe het uit te prepareren genitaal er ongeveer uit zal zien. Verdiep je goed in de structuur van de genitaliën (zie het hoofdstuk uit het boek van Tuxen), zodat je niet bij het prepareren per ongeluk wat weggooit.

Administratie
Zoals bij veel collectiezaken is een sluitende administratie erg belangrijk. Ga je vaker preparaten maken, leg dan een register of database aan met een doorlopende nummering van je preparaten. Sommige musea hanteren een eigen nummering en willen dat je die gebruikt. Dan nog kun je zo’n preparaat ook nog onder je eigen nummer registreren. Schrijf in het register of database de vindplaatsgegevens van het etiket, de sekse, de collectie waar het toe behoort, zonodig het insluitmiddel, en de datum van het preparaat; de naam van de vlinder als je die al weet, of laat dat veld leeg tot eea gedetermineerd is. Dit kun je uiteraard ook meteen in een Excel of Access bestand aanleggen, maar zorg er dan voor regelmatig een print te maken en/of backups van het bestand. Zorg dat het logboek (of de prints) bij de collectie blijft.

De geprepareerde vlinder dient ook onmiddellijk een etiket met het nummer te krijgen. Je kunt er eventueel een voorlopig nummer aanprikken en dat later vervangen door een net geprint etiket. Daarop staan bij voorkeur het nummer, de sekse (met symbool ♂, ♀ ) en jouw naam.

Etiketteren preparaten
Het etiketteren van preparaten is minstens zo belangrijk als het etiketteren van de vlinders. Preparatencollecties worden vaak apart bewaart, dus moet het etiket apart alle informatie bezitten, die ook op de etiketten van de vlinder staat. Dwz: wetenschappelijke naam, sekse, volledige vindplaatsgegevens (land, prov., plaats, coördinaten), datum, verzamelaar, voedselplant.
daarnaast informatie over het preparaat: het nummer (schrijf dat bij voorkeur op het rechter etiket, bovenaan, zodat het in een doos snel te zien is), de datum van het maken, de initialen of naam van de maker en het insluitmiddel (van belang als iemand het preparaat later wil opweken).
Schrijf met permanente inkt (o.i. inkt of goede tekenpennen), gebruik GEEN ballpoint , viltstift of zo.
Alternatief is om het te printen met goede (bij voorkeur watervaste) deskjetinkt. Eventueel op een laserprinter of kopieerder.
Het papier: gewone zelfklevende etiketten raken na verloop van tijd los, krullen om, etc. NIET gebruiken dus! Of plak het etiket van archiefkwaliteit papier met goede lijm vast, of gebruik speciale archiefkwaliteit zelfklevende etiketten (met aluminiumfolie achterzijde).
Omdat van alle etiketten onzeker is dat ze altijd blijven zitten is het verstandig altijd eerst een nummer op het glas in te krassen met een glaspen.
Berg preparaten altijd vlak liggend op, vooral in het begin. Als je een doos gebruikt, zet die dan in een kast op z’n kant als een boek, zo dat de bovenkant van de preparaten vlak ligt.


Voorbeelden van preparaatetiket voor de speld en geëtiketteerde preparaten

Procedure Prepareren

Benodigd gereedschap:
• prikplaatje van piepschuim
• Belzer pincet
• penseeltje (NOOIT in de KOH stoppen!)
• insectenspelden*
• schaartje*
• stevig wit karton waarvan je puntjes kunt knippen (ca 3-4 cm lang, uiteinde 5 mm breed)
• petrischaaltje*
• reageerbuis met 10% KOH
• alcohol 70% (spuitflesje)
• alcohol 96% (spuitflesje)
• demiwater
• Euparal* (of Canadabalsem)
• objectglas met uitholling (of eventueel zonder uitholling)*
• dekglazen*
• watervaste viltstift
• preparatenmap*
*verkrijgbaar bij Entomologie Speciaalzaak Vermandel.

1. Selecteer een vlinder
Kies het exemplaar die je wilt genitaliseren, voeg (zie hierboven) het etiket bij, die gekoppeld is aan je toekomstige preparaat.

2. Afbreken van het abdomen
Zet de mot op een prikplaatje. Breek het abdomen van de droge mot heel voorzichtig af, door het van onderen met een pincet of prepareernaald op en neer te bewegen. Goed droog materiaal breekt zo meestal makkelijk af, maar omdat ons materiaal vers is kan dat lastig zijn. In het uiterste geval kan het achterlijf afgeknipt worden.
Het achterlijf voorzichtig met een natte penseel of pincet overbrengen naar reageerbuis met een 10% oplossing van KOH. Bij kleinere vlinders moet het afbreken in een doosje gebeuren om verlies van het achterlijf te voorkomen. Zet de vlinder na het afbreken terug in de doos.
Het abdomen heeft belangrijke kenmerken, zorg daarom dat het ook netjes geprepareerd wordt!


Het prepareren van de mannelijke genitalia van de bruine eikenvlekmot, Tischeria dodonaea als stripverhaal.
Alle hierboven vermelde handelingen zijn met bovenstaande plaatjes 1-7 gedemonstreerd.

3. Maceratie
Maceratie kan gebeuren in koude KOH, maar dat duurt een nacht en is dus voor de cursus ongeschikt. Door het verwarmen van KOH wordt de procedure sterk verkort. We gebruiken een waterbad en stellen dat in op ca 90°C. Begin met ca 10 minuten. Als dat onvoldoende is kun je altijd later het achterlijf nog even langer opkoken. Bij een temperatuur van 80°C is 20 minuten nodig.

4. Schoonmaken
Breng achterlijf met genitalia over in een petrischaal met water. Probeer het uit de reageerbuis te vissen met prepareernaald of pincet, giet desnoods de buis leeg in een petrischaal. Druk het achterlijf voorzichtig leeg met penseel of uit stevig papier geknipte puntjes. Als de inhoud niet in te drukken is, moet het achterlijf nog langer macereren.
Het achterlijf kan met een fijn schaartje langs één kant worden opengeknipt of met een scalpel opengesneden.
Trek eventuele resten van darm en tracheeënstelsel voorzichtig uit het achterlijf met een pincet.
Breng het achterlijf vervolgens over naar een lage alcoholconcentratie (ca 30%) door wat alcohol bij demiwater in een schone petrischaal te mengen. Hier kan het schoonmaken verder gaan.
Ook de schubben moeten voorzichtig verwijderd worden door te drukken en wrijven met papieren puntjes of penseeltje. Doe dat niet te hard en wacht eventueel tot een volgende stap: na een langer verblijf in alcohol gaan de schubben er nl. makkelijker af.

5. Het scheiden van de genitalia en abdomen
Trek met het pincet het genitaal voorzichtig los van het zevende segment van het achterlijf. Let goed op hoe het genitaal er uit ziet en vergelijk met plaatjes. Loszittende rommel, en de endeldarm kunnen voorzichtig losgetrokken worden. Omdat de aedeagus (of phallus) belangrijke kenmerken bevat wordt die meestal uit het genitaal gehaald. Dat gaat ook weer met een pincet, doorboor omringende membranen eventueel met insectenspelden totdat de aedeagus er makkelijk uitkomt. Breng het genitaalapparaat over naar een schoon glaasje met water.

6. Uitspreiden van de valven
Om een mooi plat preparaat te maken moeten de valven naar buiten worden geklapt. Dit is één van de lastigste momenten van de procedure. Spreid in weinig vloeistof met een pincet de valven uit en houdt ze met één hand gefixeerd. Druppel met de andere hand 96% alcohol bij totdat het preparaat goed onder staat. Houd het enige tijd gefixeerd. De valven blijven dan netjes uit elkaar staan.
Als je dat bijdruppelen onhandig vind, kun je het genitaal ook overbrengen naar een glas met 96% alcohol en daar de valven uitspreiden. Je moet dan wel snel werken, anders zijn ze gefixeerd in de ingeklapte houding.

7. De aedeagus
In de taxonomie van Noctuidae wordt veel aandacht besteed aan de inwendige zak van de aedeagus of vesica. Tegenwoordig wordt die in preparaten meestal uitgestulpt als de vinger van een handschoen. Omdat dit een lastige procedure is, met een injectienaald en een nacht harden in alcohol, zullen we dat niet uitvoeren op de cursus. Soms lukt het ook door de zak er voorzichtig uit te trekken. Zie voor voorbeelden van foto’s in Fibiger (1997).

Onderdelen van het genitaal, zie externe links: vrouwelijk genitaal en mannelijk genitaal.

8. Kleuren
Om details van de genitalia goed te kunnen zien onder het microscoop, worden de genitalia vaak gekleurd. Bij de sterk gesclerotiseerde mannelijke genitalia van Noctuidae is dit echter af te raden, omdat het structuren eerder te ondoorzichtig maakt. Wel wordt de aedeagus meestal (apart) kort gekleurd in chlorazol zwart om de vesica beter zichtbaar te maken. Zo mogelijk demonstreren we dit.
Vrouwelijke genitalia worden vrijwel altijd gekleurd met chlorazol zwart (ze zijn veel minder sterk gesclerotiseerd) en bij kleinere vlinders de mannetjes meestal ook met allerlei rode kleurstoffen (haemaluin of eosine of orange-g). Pas op, kleurstoffen zijn vaak giftig!

9. Laatste handelingen
Breng nu alles over naar schone alcohol 96% en probeer zoveel mogelijk de schubben van het achterlijf te verwijderen. Breng daarna terug in 70% alcohol en maak tenslotte hieruit een preparaat in euparal. Druppel wat euparal op een objectglas met uitholling, een klein druppeltje is voldoende. NB: in het stripverhaal, afkomstig uit een cursushandleiding, is gebruik gemaakt van glycerine.
Rangschik de structuren netjes naast elkaar, links het abdomen (achterkant naar boven) , daarnaast de genitalia met uitgespreide valven (uncus wijst naar boven) en daaronder weer de aedeagus.
Laat het dekglas voorzichtig zakken. Met een insectenspeld kun je eventueel de structuren nog herrangschikken onder het dekglas. Het preparaat is nu klaar voor bestudering en tekenen.
Schrijf gegevens (en je naam) kort op het objectglas met watervaste viltstift. Berg het preparaat tijdens de cursus op in een preparatenmap (tenminste één per tafel).


Vervolg van het stripverhaal.
Alle hierboven vermelde handelingen zijn met bovenstaande plaatjes 8-20 gedemonstreerd.

10. Permanente preparaten
Om permanente preparaten te maken heb je een insluitmiddel nodig, bijv. euparal. De onderdelen moeten dan eerst goed ontwaterd worden in een badje alcohol 96% of 100%, waarna het direct kan worden overgebracht naar een druppel euparal.
Om preparaten goed te kunnen gebruiken is het erg handig als het genitaal altijd ongeveer in het midden ligt. Bovendien moet het dekglas qua grootte passen bij de grootte van het genitaal. Je hoeft dan niet lang te zoeken. De hoeveelheid Euparal dient daaraan aangepast te worden, zodat er geen grote klodders onder het dekglas vandaan komen, maar let er op dat het middel nog krimpt bij droging. Na het drogen (bijv. in een stoof bij 40°C) moet het preparaat netjes geëtiketteerd worden (zie boven).


Het preparaat voordat het dekglas er op is gelegd (links), en het definitieve eindresultaat (rechts).

Andere preparaten
Beheers je eenmaal de techniek, dan kun je ook preparaten maken, zoals van vleugels, rupsen, andere onderdelen van insecten.

DNA en genitalia
Een mooie methode om de kool en de geit te sparen, dwz het DNA tijdens het prepareren, is om ipv KOH, proteinase K te gebruiken om de eiwitten op te lossen. Dit kan met een gewoon Qiagen kitje, je maakt alleen het preparaat niet fijn, maar laat het intact overnachten in het waterbad, waarna je het abdomen voorzichtig (met schone apparatuur!) leegdrukt. het achterlijf met genitaal breng je over in een petrischaaltje met alcohol, het extract blijft in een epje en volgt de verdere extractie procedure.
Je hebt dan een perfect voucher. Met deze methode is DNA barcoding aan museum materiaal mogelijk. Zie Knölke et al. (2005) voor het protocol.
Omdat DNA vrij makkelijk degradeert zijn er wel voorwaarden aan het materiaal dat men zo wil behandelen: opweken is uit den boze, dus alleen snel opgezet en gedroogd materiaal (of materiaal in alcohol) is geschikt. Sommige chemicaliën zijn ook slecht voor DNA. Op dit moment werkt deze methode voor goed gedroogd materiaal van maximaal 10-15 jaar oud, maar mogelijk dat in de toekomst ook ouder materiaal bewerkt kan worden.

Literatuur
Fibiger, M., 1997; Noctuidae Europaeae Vol. 3 Noctuinae III. – Entomological Press, Sorø. 418pp.
Klots, A. B., 1970. Lepidoptera. - In: S. L. Tuxen (Ed.), Taxonomist's glossary of genitalia in insects. Second revised and enlarged edition. 115-130. Munksgaard, Copenhagen.
Knölke, S., S. Erlacher, A. Hausmann, M. A. Miller & A. H. Segerer, 2005. A procedure for combined genitalia dissection and DNA extraction in Lepidoptera. - Insect Systematics and Evolution 35 (4): 401-409.
zie ook: http://www.dissectiongroup.co.uk/page44.html

 
 
  © All content copyright www.microlepidoptera.nl and allied photographers.